Материалы отчета РФФИ
Ваш браузер устарел и не обеспечивает полноценную и безопасную работу с сайтом. Пожалуйста обновите браузер, чтобы улучшить взаимодействие с сайтом.

В 2014 году коллектив сотрудников и студентов кафедры биоинженерии и биоинформатики выполнил исследование «Изучение молекулярных механизмов ремоделирования суставного хряща с позиций феномена мозаичности структур и функций» при финансовой поддержке РФФИ в рамках Проекта № 14-04-01679 а.

 

            Аннотация                                                                                                             

В работе с использованием современных количественных морфологических и иммуногистохимических методов показана микрокластерная организация гиалинового хряща  крупных суставов млекопитающих,  дана детальная структурно-функциональная характеристика микрокластеров и особенности фенотипа хондроцитов в их составе. Конкретизированы основные механизмы, определяющие наличие мозаично расположенных структур в суставном хряще. Построена рабочая модель молекулярных взаимоотношений, объясняющая формирование мозаичных структур в суставном хряще в процессе его естественного самообновления, а также, частично, объясняющая особенности биомеханики суставной поверхности при опосредовании статических и динамических нагрузок на сустав. В модели экспериментального остеоартроза и индуцированного ремоделирования хрящевой ткани показана динамика мозаично организованных структур, сопоставлен фенотип хондроцитов и их микроокружения в мозаичных структурах неизмененного хряща и патологических кластерах при  остеоартрозе. Создана пилотная версия базы знаний, включающая в себя сведения о молекулярных игроках и событиях, лежащих в основе феномена мозаичности суставного хряща и его изменений при ремоделировании ткани. Полученные данные позволили детализировать механизмы ремоделирования хряща и обосновать новые подходы к восстановлению его повреждений.  

 

Актуальность Проекта.

Основная проблема, на решение которой направлено настоящее исследование – определенный разрыв между последними достижениями в области молекулярной биологии опорных тканей (в частности, хряща) и практическими приложениями регенеративной биомедицины, которые по-прежнему базируются на традиционном подходе эволюционных изменений в методиках, и в малой степени опираются на фундаментальные закономерности дифференцировки и ремоделирования этих тканей. При этом совершенно игнорируется общебиологический принцип мозаичности, согласно которому более устойчивыми и адаптивными являются сложные структуры, обладающие пространственной неоднородностью (мозаичностью) строения и свойств.

 

Цели Проекта.

1. Подтвердить феномен мозаичности строения суставного хряща, установить пределы распространенности, размерность выявленных мозаичных структур, дать им структурно-функциональную характеристику.

2. Выяснить механизмы формирования мозаичных структур и их роль в ремоделировании хрящевой ткани

3. Доказать участие мозаичных структур в ремоделировании хрящевой ткани в ответ на изменяющие средовые условия (на модели экспериментального остеоартроза и репаративной регенерации хряща после механического повреждения).

4. Создать базу данных о молекулярных игроках и событиях, лежащих в основе феномена мозаичности суставного хряща и участия этих событий в ремоделировании хрящевой ткани.

 

Основные результаты Проекта.

Показано, что при исследовании коленных суставов собак, кроликов и белых крыс, а также бедренных и плечевых суставов кроликов (животные не подвергались каким-либо экспериментальным воздействиям) на светооптическом уровне строение гиалинового хряща крупных суставов может быть охарактеризовано как мозаичное, с выделением в его составе (помимо общепринятого деления на зоны), особых участков  - микрокластеров. Они представляют собой повторяющиеся, мозаично расположенные участки с нечеткими границами, отличающиеся от окружающегося хряща относительно более плотной структурой экстрацеллюлярного матрикса и более высокой численной плотностью хондроцитов. Микрокластеры занимают в нагружаемых областях сустава от 30% до 50% объема хряща, имеют при трехмерной реконструкции форму полигональных колонок или усеченных пирамид с поперечником порядка 80-120 мм вблизи остеохондральной линии и расширяющиеся до 150-250 мкм к наружной зоне хряща.

Детально охарактеризованы различия фенотипа хондроцитов и их микроокружения в составе микрокластеров и вне их состава. Как минимум, они заключаются в относительно большей способности к пролиферации и внутриклеточной регенерации (маркеры PCNA, Ki-67 в базальной зоне хряща),  высокой экспрессии аггрекана в средней зоне и лубрицина – в поверхностной зоне хряща, относительной меньшей экспрессии проапоптотических маркеров (TRAIL, каспаза-3), преобладанием экспрессии ингибиторов металлопротеиназ (TIMP-1, TIMP-3) над экспрессией тканеспецифичных металлопротеиназ (MMP-9, MMP-13).

Конкретизированы основные механизмы, определяющие наличие мозаично расположенных структур в суставном хряще. Построена рабочая модель молекулярных взаимоотношений, объясняющая формирование мозаичных структур в суставном хряще в процессе его естественного самообновления, а также, частично, объясняющая особенности биомеханики суставной поверхности при опосредовании статических и динамических нагрузок на сустав.

Сконструированы последовательности ДНК-зонды к таргетным молекулам РНК для флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), проведена пробоподготовка (забор по принципу по принципу multi-sampling) для выявления транскриптов, связанных с формированием в суставном хряще мозаичных структур методом супрессионной вычитающей гибридизации.

В модели двусторонней перерезки передних крестообразных связок у белых крыс показана динамика мозаично организованных структур в ремоделировании суставного хряща при развитии экспериментального остеоартроза коленного сустава. Показано, что по мере развития остеоартроза постепенно утрачивается микрокластерная структура нагружаемых областей сустава. В поверхностной и средней зонах он становится более однородным и менее плотным, нарушается продукция аггрекана и лубрицина; в базальной зоне формируются классические патологические кластеры хондроцитов с характерной гиперцеллюлярностью и неоднородностью плотности экстрацеллюлярного матрикса, нарушаются структурные соотношения с подлежащей костью, появляются единичные остеофиты.

Сопоставлен фенотип хондроцитов и их микроокружения в мозаичных структурах неизмененного хряща и патологических кластерах при  остеоартрозе. В частности, показано, что для патологических кластеров характерен крайне низкий уровень пролиферативной и репаративной активности, относительно более низкая экспрессия TRAIL и каспазы-3, высокая экспрессия тканеспецифических металлопротеиназ и их ингибиторов, присутствует экспрессия маркеров васкуляризации (PECAM-1, NOS-3), остеогенеза (остеонектин) и остеорезорбции (CD68).

В модели ремоделирования гиалинового хряща коленного сустава крыс, индуцированного постановкой металлического имплантата с биоактивной поверхностью в прилежащий участок бедренной кости, было показано, что ремоделирование сопровождается фазовыми нарушениями мозаичной организации хряща, при которой полнослойный характер микрокластеров утрачивается на 4-й неделе с момента операции и восстанавливается к 12-й неделе по мере завершения процесса приживления имплантата и завершения ремоделирования суставного хряща.

Создана и размещена на интернет-ресурсе в режиме открытого доступа пилотная версия базы знаний, включающая в себя интеллектуальную схему формирования мозаичных структур в хряще с системой активных ссылок и вспомогательную базу данных (о молекулярных игроках и событиях, лежащих в основе феномена мозаичности суставного хряща и его изменений при ремоделировании ткани.

 

 

Некоторые иллюстрации к Проекту.

 

Безымянный12.png

Безымянный13.png

Конфокальная лазерная микроскопия неизмененного суставного хряща коленного сустава кролика с визуализацией ядер хондроцитов и матрикса с помощью этидия бромида. Слева – горизонтальный захват, видны микрокластеры хондроцитов. Справа – фронтальный захват, программой выделены ядра для морфометрии. Исследования проведены в Пущинском научном центре РАН. Соисполнитель – И.А. Фадеева,  к.б.н., старший научный сотрудник лаборатория фармакологической регуляции клеточной резистентности Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук.

 

Безымянный14.png

Безымянный15.png

Начальные изменения суставного хряща при экспериментальном остеоартрозе у крыс. Слева – уменьшение признаков микрокластерной организации хряща в окраске сафранином О. Справа – уменьшение экспрессии луюрицина в поверхностных слоях суставного хряща. Иммуногистохимия, визуализации щелочной фосфатазой. Фото В.В. Новочадова.

 

Безымянный16.png

Безымянный17.png

Выявление матриксной металлопротеиназы MMP-13 (слева) и каспазы-3 (слева) в суставном хряще кролика. Иммуногистохимия, флуоресцентный способ визуализации. Фото Е.Ю.Шуваловой.

 

Безымянный18.png

Безымянный19.png

Слева. Распределение плотности матрикса при сканировании гиалинового хряща крысы параллельно суставной поверхности с шагом 25 мкм. Микрокластеры выделены стрелками. Справа. Зависимость размеров хондроцитов в кластерах лот расстояния их до поверхности хряща. Коленный сустав крысы.

 

Распределение фенотипических маркеров в хондроцитах и их окружении в концепте мозаичности строения суставного хряща

 

Маркер

Модель

В микро- кластерах

Вокруг микрокластеров

В патологических кластерах

PCNA,

Норма, кролики

Высокая

меньше

-

ОА, крысы

Умеренная

Высокая

Ki-67

Норма, кролики

Высокая

меньше

-

ОА, крысы

Умеренная

Высокая

CD68

ОА, крысы

нет

нет

Низкая

CD31

ОА, крысы

нет

нет

Низкая

NOS-3

Норма, кролики

нет

нет

-

ОА, крысы

нет

нет

Низкая

TRAIL

Норма, кролики

Меньше

Высокая

-

ОА, крысы

Низкая

Низкая

Каспаза-3

Норма, кролики

Низкая

Умеренная

-

 

ОА, крысы

Умеренная

Низкая

Аггрекан

Норма, кролики

Высокая

Низкая

-

Лубрицин

 

Норма, кролики

Только в поверхностной

зоне хряща

-

MMP-9

Норма, кролики

Меньше

Высокая

-

ОА, крысы

Умеренная

Высокая

MMP-13

Норма, кролики

Меньше

Высокая

-

TIMP-1

Норма, кролики

Высокая

Низкая

-

ОА, крысы

Высокая

Меньше

Высокая

TIMP-3

Норма, кролики

Высокая

Низкая

-

Остеонектин

ОА, крысы

Нет

Нет

Низкая.

Виментин

ОА, крысы

Умеренная

Высокая

Высокая

 

Результаты данного Проекта соответствуют:

- приоритетному направлению развития науки, технологий и техники РФ – Науки о жизни;

- критической технологии РФ - Биомедицинские и ветеринарные технологии;

- основному направлению технологической модернизации экономики России - Медицинские и биотехнологии.

 

Опубликованные работы по Проекту 

1. Новочадов В.В., Алексеенко А.Ю., Крылов П.А., Шувалова     Е.Ю. Признаки мозаичного строения гиалинового хряща: количественное морфологическое исследование локтевого суставов кролика // Российский медико-биологический вестник  им. академика И.П. Павлова. – 2014. – № 3. – С. 33-39.

2. Shiroky A.A., Volkov A.V., Novochadov V.V. Crucial processes' interaction during the renewal of articular cartilage: the mathematical modeling // Eur. J. Mol. Biotech. – 2014. – Vol. 2, №2. – P. 86-94.  

3. Новочадов В.В., Крылов П.А.. Кластерное распределение плотности  матрикса в гиалиновом хряще: доказательства  при исследовании коленного сустава кролика // Клиническая и экспериментальная морфология. – 2014. – № 3. – С. 33-39. 

4. Novochadov V.V., Bovol’skaya K.A., Lipnitzkaya S.A., Perevalova E.V., Shuvalova E.Yu., Zagrebina Z.N., Zaytzev V.G. Different phenotype of chondrocytes in articular cartilage: mapping, possible mechanisms, and impact to implant healing // Eur. J. Mol. Biotech. – 2014. – Vol. 2, №4. – P. 3-14.  

5. Новочадов В.В., Крылов П.А, Зайцев В.Г. Неоднородность строения гиалинового хряща коленного сустава у интактных крыс и при экспериментальном остеоартрозе // Вестник Волгоградского государственного университета. Серия 11: Естественные науки. – 2013. – № 4. – С. 6-15.

6. Новочадов В.В. Широкий А.А.  Поиск показателей достижения цели в системе ремоделирования суставного хряща // XII Всероссийское совещание по проблемам управления ВСПУ-2014. Москва, 16-19 июня 2014 г. : труды. [Электронный ресурс]. – М.: ИПУ РАН 2014. – С. 6775-6781.